脊髓IL-33及受体ST2在小鼠炎症痛及电针镇痛中的作用及机制

【摘要】炎症痛是由多种原因(包括创伤、细菌、病毒感染以及外科手术)导致的外周组织受损所引起的持续性的疼痛状态。作为最常见的病理性疼痛之一,炎症痛是困扰临床的一大难题。目前临床上常用的抗炎镇痛药存在着长期服用效果不理想及副作用大的特点。因此,有关炎症痛的发生机制一直是国内外的研究热点,然而其确切机制尚未完全明确。大量临床实践和基础研究表明针刺可以缓解炎症痛,且副作用小,但机理仍不十分清楚,需要深入研究。Interleukin-33(IL-33)是2005年Schmitz等人新发现的一种炎性细胞因子,基因序列和结构与IL-1家族其他成员IL-1p和IL-18相似。其受体ST2属于Toll样受体家族成员。研究表明,IL-33是各种炎症性疾病的潜在介质。有文献报道,外周IL-33参与炎症痛。课题组前期预实验结果表明,IL-33及受体ST2在正常大鼠脊髓中有表达,且在关节炎痛时表达显著上调,提示脊髓IL-33及受体ST2可能参与炎症痛。电针可以下调炎症痛时脊髓增加的IL-33水平,提示IL-33可能参与电针缓解炎症痛过程。IL-33与其受体ST2结合后能够导致髓样分化因子MyD88和核因子NF-KB信号途径的活化,进而导致MAPK通路ERK、p38、JNK的磷酸化。文献报道及本实验室前期工作表明,脊髓MAPK通路参与各种病理性疼痛(炎症痛、神经痛、癌痛)的发生发展过程。炎症痛的中枢机制研究表明,炎症能导致中枢神经系统发生敏感化。近年来,胶质细胞是慢性疼痛研究的热点。在痛觉的初级整合中枢–脊髓,胶质细胞可以直接调节神经元的活动和兴奋性,在痛觉调制尤其是慢性痛中枢敏化的形成与维持中起着举足轻重的作用。本课题组前期研究也表明,脊髓胶质细胞激活在大鼠关节炎痛和电针镇痛中发挥重要的作用。文献报道,中枢星形胶质细胞能够表达IL-33;ST2则可以表达于中枢神经元及星形胶质细胞。那么炎症痛时,脊髓内星形胶质细胞中的IL-33是否表达增加,继而通过自分泌和(或)旁分泌的方式作用于星形胶质细胞或神经元细胞膜表面的ST2受体来介导炎症痛的发生发展?电针是否通过调节脊髓IL-33及受体ST2发挥镇痛作用?而其下游MAPK信号通路是否参与上述过程呢?这是本课题需要研究的内容。因此,本课题在经典的Formalin诱发的急性炎症痛小鼠模型及CFA(CompleteFreund’sAdjuvant)诱发的慢性炎症痛小鼠模型上,给予ST2基因敲除、rIL-33、抗ST2抗体及电针等干预手段,观察小鼠的自发性痛行为(自发性抬脚、舔爪及自发性超声)及诱发性痛行为(机械性痛觉超敏、热痛觉过敏),并利用免疫荧光结合激光共聚焦技术、Real-timePCR技术、WesternBlot技术等,(1)观察脊髓IL-33及受体ST2在小鼠急、慢性炎症痛的发生、发展中的作用,明确IL-33及受体ST2在小鼠脊髓的细胞定位,初步探讨脊髓IL-33及受体ST2参与急、慢性小鼠炎症痛的机制；(2)观察电针对小鼠急、慢性炎症痛的镇痛作用：(3)观察IL-33及受体ST2是否参与电针镇痛,初步探讨脊髓IL-33及受体ST2参与电针镇痛的机制。本实验获得如下主要结果：1.脊髓IL-33及受体ST2在小鼠炎症痛中的作用及机制建立小鼠Formalin急性炎症痛及CFA慢性炎症痛动物模型,并应用自发痛行为学实验(自发性抬脚、舔爪及自发性超声)及诱发痛(机械性痛觉超敏、热痛觉过敏)行为学实验完成模型评价。足底皮下给予20μl5%Formalin,诱发小鼠两相自发性抬脚及舔爪的伤害性行为,自发性超声也显著增多。足底皮下给予20μlCFA引起小鼠的机械性痛觉超敏及热痛觉过敏。在ST2基因敲除的小鼠上,与野生型(WT)模型对照组相比,由皮下注射Formalin引起的小鼠的急性炎症痛(自发性抬脚、舔爪及自发性超声)显著降低；与野生型(WT)模型对照组相比,ST2基因敲除后,CFA慢性炎症痛模型小鼠的两侧的热痛阈(缩爪潜伏期)均显著升高(造模后4h、1d、7d)。与NS组相比,皮下或鞘内注射大剂量rIL-33能显著增加正常小鼠的自发痛行为(自发性抬脚及舔爪)。与Formalin+PBS对照组相比,皮下或鞘内注射rIL-33显著增加Formalin急性炎症痛模型小鼠的自发痛行为(自发性抬脚及舔爪)；与Formalin+IgG对照组相比,皮下或鞘内注射抗ST2抗体能显著降低Formalin急性炎症痛模型小鼠的自发痛行为(自发性抬脚及舔爪)；与Formalin+IL-33组相比,皮下或鞘内注射抗ST2抗体显著降低外源性给予rIL-33所引起的Formalin急性炎症痛小鼠的自发痛行为(自发性抬脚及舔爪)的增加。免疫荧光结果表明,IL-33表达于小鼠脊髓星形胶质细胞,其受体ST2表达于脊髓星形胶质细胞及神经元。行为学结果还显示,皮下注射阿片类受体阻断剂纳洛酮,对皮下注射抗ST2抗体缓解Formalin急性炎症痛的自发性抬脚及舔爪行为无显著影响。WesternBlot结果表明,与Formalin模型组相比,皮下给予抗ST2抗体显著降低Formalin急性炎症痛小鼠的脊髓内pERK的表达。Real-timePCR结果表明,CFA模型造模后1d、7d时,小鼠脊髓内IL-33mRNA表达显著升高。2.电针缓解小鼠炎症痛中镇痛作用在小鼠Formalin急性炎症痛模型上,与假电针对照组相比,电针显著降低Formalin模型小鼠的两相的自发性抬脚时间及第一相的自发性舔爪时间。在小鼠CFA慢性炎症痛模型上,与假电针对照组相比,电针显著升高CFA模型造模后不同时间点(4h/6h、1d、7d)小鼠两侧的机械性痛阈及热痛阂(缩爪潜伏期),显著缓解皮下注射CFA引起的小鼠机械痛觉超敏及热痛觉过敏行为。3.脊髓IL-33及受体ST2在电针缓解小鼠炎症痛中的作用及机制在ST2基因敲除小鼠上,与CFA+EA组小鼠相比,小鼠的热痛觉过敏行为也得到进一步缓解,热痛阈(缩爪潜伏期)显著升高。与Formalin+EA+PBS组小鼠相比,皮下注射或鞘内注射rIL-33显著加重了电针组Formalin模型小鼠的自发痛行为(包括自发性抬脚及舔爪)；与Formalin+EA+IgG组小鼠相比,皮下或鞘内注射抗ST2抗体则进一步缓解电针组Formalin急性炎症痛模型小鼠的自发痛行为(自发性抬脚及舔爪)。WesternBlot结果表明,与电针组Formalin模型小鼠相比,皮下注射抗ST2抗体显著降低电针组Formalin急性炎症痛模型小鼠脊髓pERK表达。综上所述,本研究提示：1.外源性给予rIL-33显著性增加正常小鼠的自发性抬脚、舔爪时间,提示IL-33对正常动物有致痛作用。2.IL-33通过其受体ST2参与调节Formalin引起的小鼠急性炎症痛及CFA引起的小鼠慢性炎症痛。3.脊髓IL-33及受体ST2通过脊髓MAPKERK信号通路参与调节Formalin引起的小鼠急性炎症痛。4.脊髓IL-33及ST2受体参与电针缓解Formalin引起的小鼠急性炎症痛及CFA引起的小鼠慢性炎症痛过程。5.脊髓IL-33及受体ST2通过脊髓MAPKERK信号通路参与电针缓解Formalin引起的小鼠急性炎症痛过程。
【作者】韩萍；
【导师】王彦青；
【作者基本信息】复旦大学，中西医结合基础，2013，博士
【关键词】IL-33；ST2；炎症痛；电针镇痛；MAPKERK通路；脊髓；

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